Research support
Razvoj sustava za proizvodnju biomarkerom obilježenih monoklonskih antitijela
Monoklonska antitijela (mAt) predstavljaju ključne reagencije u istraživanju i karakterizaciji različitih proteina (proteoma) te imaju vrlo široku primjenu u dijagnostici i terapiji humanih bolesti. Obilježavanje mAt biotinom povećava njihovu vrijednost i iskoristivost u brojnim aplikacijama. Na primjer, na biotinilirana mAt se mogu vezati streptavidinom (SA) konjugirani flourokromi, enzimi, radioaktivne tvari i druge kemijske supstance (npr. citostatici), a ista se mogu imobilizirati i na SA obložene solidne podloge (npr. biočipovi). No, kemijsko biotiniliranje lizinskih ostataka proteina jest nasumično, pa nosi rizik od smanjena broja i afiniteta aktivnih veznih mjesta zbog narušavanja konformacije proteina, nepredvidive mogućnosti vezanja za solidnu SA obloženu podlogu i kemijskog narušavanja strukture dijela proteina tijekom samog kemijskog procesa biotinilacije.
U ovom projektu smo razvili biološki sustav za proizvodnju biotinom obilježenih mAt koji se temelji na specifičnoj enzimatskoj biotinilaciji proteina i klasičnoj tehnologiji proizvodnje monoklonskih protutijela. U prirodi je najbolje proučena biotin ligaza bakterije E.coli (BirA) koja specifično biotinilira lizinski ostatak u okviru specifičnog proteinskog slijeda kojega prepoznaje. U našem sustavu smo najprije razvili mišju mutantu (KAC) kojoj je ciljanom mutacijom gena modificiran laki imunoglobulinski (Ig) lanac i čiji limfociti B proizvode lake Ig lance obilježene specifičnim slijedom koji prepoznaje BirA (AviTag). Utvrdili smo da laki Ig lanci KAC mutante, unatoč dodanom biljegu, stvaraju komplekse (antitijela) u normalnim količinama i omjerima sa svim klasama teških Ig lanaca. Imunizacijom KAC mutante stranim antigenom dobili smo obilježena antitijela (AviTag) koja su bila sposobna specifično prepoznati strane antigene sa jednakim afinitetom kao i antitijela kontrolnih nemutiranih miševa. Drugi dio našeg sustava se sastoji od genetski modificirane mijelomske linije (SP2O) koja je stabilno transficirana s BirA transgenom, kao fuzijskim partnerom. Fuzijom SP2O-BirA mijelomske linije i aktiviranih splenocita iz specifično imuniziranih KAC miševa dobili smo hibridomske klonove koji su proizvodili biotinilirana mAt specifična za odgovarajuće antigene. Ova antitijela su kasnije ispitana u različitim metodama u kojima su pokazala svoju funkcionalnu upotrebljivost.
Sustav za proizvodnju biotiniliranih mAt predstavlja elegantan način za proizvodnju kontrolirano biotiniliranih reagencija već tijekom njihove proizvodnje. Osim poznatog mjesta biotinilacije (jedno mjesto na svakom lakom Ig lancu) i njihove pogodnosti pri imobilizaciji na solidne SA obložene podloge, ovaj sustav nudi i određenu fleksibilnost kroz biotinilaciju različitih klasa imunoglobulina i mogućnost upotrebe biotiniliranih F(ab)2 fragmenata. S obzirom na sve veće potrebe i brojne inicijative u svijetu za masovnom proizvodnjom mAt na različite proteome, a od kojih se jedna ostvaruje i na Medicinskom fakultetu u Rijeci u okviru Centra za proteomiku, očekujemo da će ovaj projekt doprinijeti proizvodnji novih konkurentnih reagencija, naročito prilagođenih za masovno istraživanje proteoma (npr. proteinskih čipova), čime bi se stvorile pretpostavke za daljnji znanstveni i biotehnološki razvoj Medicinskog fakutleta Sveučilišta u Rijeci.